중앙대학교 생명과학과 김근필 교수 연구팀은 유전체 안정화 (genomic integrity) 유지를 위한 배아줄기세포 특이적 유전체 손상 및 회복 기전에 대한 연구를 진행하고 있다. 유전자 손상이 발생하면 배아줄기세포 특이적인 빠르고 효율적인 대응 기작이 정교하게 조절되어 유전체 안정화에 기여한다. 특히 배아줄기세포의 유전체 안정화가 유지되지 않으면 유전체에 돌연변이가 차츰 축적되게 되어 각 기관 및 조직으로 분화되는 세포가 비정상적인 돌연변이를 보유하게 되고 분화된 체세포는 본래의 기능을 수행할 수 없게 된다. 이러한 유전자 손상에 따른 회복의 조절기작이 제대로 기능하지 못하게 되면 돌연변이세포 및 암세포로의 분화가 이루어질 가능성이 높아지게 된다. 종양줄기세포의 분열 및 분화에 대한 분자생물학적 접근 및 관심이 점점 증대되고 있고, 우리 연구진은 줄기세포에서의 유전체 손상과 회복에 대한 기전 연구에 매진하고 있다.

■ 줄기세포 특이적 유전체 손상 및 회복 기전 연구 현황
배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포로 대표되는 줄기세포 연구는 세포치료제 개발, 질병 모델링 및 신약개발 등에 활용되는 경제․산업적 중요성뿐만 아니라 개체발생과 분화와 관련된 전반적인 생물학적 기반지식을 이해하는데 광범위하게 활용되는 학문적 중요성을 동시에 가지고 있다. 개체발생이나 조직재생에 있어서 줄기세포의 역할을 근거로, 생체내에 존재하는 줄기세포는 엄격한 유전체 안정성 유지 기작을 가지고 있을 것으로 추정된다. 줄기세포의 유전체 안정성이 유지되지 않을 경우 유전체 내에 돌연변이가 축적되게 되고, 이는 아래그림에서 제시된 바와 같이 줄기세포의 응용을 저해하는 가장 큰 장애물이 될 수 있다. 또한, 줄기세포에서부터 야기된 성체세포의 다른 형태는 인간의 몸 전체, 즉 피부, 각종 장기 및 조직을 구성하며 인체는 이러한 줄기세포를 통해 노화, 화학적, 물리적 스트레스 및 종양세포 혹은 방사선 피폭에 의해 손실된 세포를 회복할 수 있는 기능을 가진다. 세포 내 유전자의 손상이 발생할 경우, 줄기세포는 일련의 복잡한 과정을 통해 이루어지며 세포 및 유전체 손상의 회복 과정이 정교히 구성된 기전에 의해 이루어지며, 산화 스트레스, 온도, 방사선 피폭 등에서의 유전체 손상은 거의 모든 조직에 성체줄기세포의 수를 감소시키며 일정 부분의 세포는 다시 유전체 회복과정을 거쳐 정상기능을 갖추게 된다. 유전체 손상 조절 실패는 줄기세포의 예측하지 못한 암세포로의 분화가 가능하며, 따라서 줄기세포의 유전자 안정화에 대한 분자생물학적 기전에 대한 정보를 바탕으로 효과적인 세포 분화 유도 및 암 질환 등 다른 관련 질병과의 연관성을 예측하고 진단하기 위한 연구기 필요하다. 특히 UV radiation 혹은 산화스트레스는 p53을 통해 Wnts등의 신호전달 과정이 이루어지며 이를 통해 세포는 세포 사멸 혹은 생존과정을 거치게 되지만, 줄기세포 특이적 유전자 수선 과정인 homologous recombination 과정을 통한 유전자 안정화 기전 및 세포배양 효율 증대를 위한 연구는 국내외적으로 미흡한 환경이라 판단된다.

가. 줄기세포 복제효율 조절을 통한 종양형성 억제 연구

배반포의 inner cell mass는 발생학적으로 embryo를 형성하는 초기단계 세포이므로 이 세포의 유전체 돌연변이 저항성이나 replication integrity 유지능력은 정상적인 개체 발생을 위해 필수적이며, 실제로 배아줄기세포의 replication 및 세포 주기, DNA damage response는 체세포와 차이가 있음이 보고되고 있다.

배아줄기세포의 자가재생산과 다분화능

예를 들어, 배아줄기세포는 DNA 복제 저해제에 노출되었을 때 세포주기의 S-phase check point를 활성화시켜 repair를 하기보다는 세포사멸을 유도함으로써 제거하는 기작을 가지고 있다 (Desmarais JA et al., 2012). 구체적으로, replication inhibitor에 노출되었을 때 ssDNA가 형성되지 않기 떄문에 CHK1이 활성화되지 않고 대신 세포사멸기작이 활성화되면서 증식이 억제된 세포를 제거하게 된다. 이는 복제에 이상이 있는 세포를 신속하게 제거함으로써 줄기세포의 종양화 가능성을 차단하는 기작으로 이해되고 있다. 줄기세포의 유전체 안정성 유지는 줄기세포뿐만 아니라 거기에서 분화되는 세포의 종양화를 억제한다는 측면에서 매우 중요하다고 할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 줄기세포의 장기적인 체외배양에 의해 필연적으로 수반되는 유전체의 불안전성은 세포치료제로 개발한 줄기세포의 임상학적 적용을 가로막는 가장 큰 장애라고 할 수 있다. 따라서, in vitro 배양과정의 줄기세포 내에서 일어나는 replication 및 DNA damage 조절 기작을 정확히 이해하고 이 기작을 조절할 수 있는 기술을 개발하는 것은, 줄기세포의 세포치료제 개발을 위해 필수적이다. 본 연구진은 선행연구를 통해 상동재조합으로 DNA의 double-strand break 수선 기능을 수행하는 Rad51 유전자가 배아줄기세포에서 특이적으로 과발현되고 있으며, 세포주기 S-phase에서 DNA replication에 핵심적인 역할을 수행을 확인하였다. 이에 배아줄기세포는 돌연변이가 일어난 DNA를 가진 세포를 정밀하게 교정하거나 또는 예민하게 감지하여 세포사멸을 통해 제거하고 정상적인 DNA만을 replication 함으로써, 세포의 종양화를 최소화하는 것이 필수적이므로, 상동재조합 기작이 배아줄기세포 내에서 DNA replication을 조절하는 기작을 정확하게 이해함으로써, 정상 DNA만을 replication하고 비정상 DNA를 감지하여 세포사멸을 유도할 수 있는 기술을 개발하고자 한다.

나. 상동 재조합인자 발현조절을 통한 유도만능줄기세포 제작 효율성 연구

상동재조합과 관련된 인자들이 배아줄기세포에서 과발현되었다가 분화가 진행되면서 급격하게 발현이 감소한다는 사실을 바탕으로 상동재조합인자가 역분화 유도인자와 더불어 역분화 효율을 증진시킬 수 있는지를 검증이 필요하며, 특히 상동재조합인자가 DNA replication을 조절함으로써 유전체 안정성을 유지할 경우, 역분화과정에서 유전체 안정성을 높임으로써 역분화 효율을 높일 가능성이 매우 높다고 판단된다. 상동재조합인자의 역분화 효율검증을 위하여 상동재조합에 기여하는 인자에 대한 바이러스를 제작하고 역분화 유도인자와의 공동처리결과 역분화 효율 증대를 분석함과 동시에 제작된 역분화 줄기세포의 유전적 안정성을 chimeric embryo의 형성능력을 통해 분석할 예정이다. New Jersey 주립대학교의 Serrano 박사팀은 배아줄기세포에서 상동재조합에 관여하는 Rad51이 cell cycle 전반에 걸쳐 과량 발현되고 있으며 이는 double strand break등 손상된 배아줄기세포의 genomic DNA를 빠르게 수선함으로써 genome integrity를 높이기 위함이라고 주장하였다 (Serrano et al. Stem Cells & Dev. 2011).

ESC에서 Rad51의 발현 패턴

1:Lee MS, Yu Mi, Kim KY, Park GH, Kwack K, and Kim KP*. Functional validation of rare human genetic variants involved in homologous recombination using Saccharomyces cerevisiae. PLoS One 10(5): e0124152
2:Yoon SW, Kim DK, and Kim KP* Park KS Rad51 Regulates Cell Cycle Progression by Preserving G2/M Transition in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. (2014) 23(22): 2700-2711
3:Zhang L, Wang S, Yin S, Hong S, Kim KP, and Kleckner N. Topoisomerase II mediates meiotic crossover interference. Nature. 2014 Jul 13. doi: 10.1038/nature13442.
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5:Soogil Hong and Keun P. Kim*. Shu1 promotes homolog bias of meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cells (2013) 36: 446-454.
6:Liangran Zhang, Keun P. Kim, Nancy Kleckner, Aurora Storlazzi. Meiotic double-strand breaks occur once per pair of (sister) chromatids and, via Mec1/ATR and Tel1/ATM, once per quartet of chromatids. PNAS (2011) 108(50): 20036-20041.
7: Kim KP, Weiner BM, Zhang L, Jordan A, Dekker J, Kleckner N. Sister Cohesion and Structural Axis Components Mediate Homolog Bias of Meiotic Recombination. Cell (2010) 143 (6): 924-937.