Engineering of a Histone-Recognition Domain in Dnmt3a Alters the Epigenetic Landscape and Phenotypic Features of Mouse ESCs. Mol Cell. 2015 Jul 2;59(1):89-103.

Histone modification과 DNA methylation이 서로 다른chromatin의 조절요소로서 발달과정동안 gene expression을 변화시키는데 중요하다는 점은 잘 알려져 있지만, 이 두가지 요소가 어떻게 연결되고 서로 영향을 주는지는 잘 알려져 있지 않다. 이전의 연구에서 histone H3 lysine 4 trimethylation (H3K4me3)이 CpG islands에 위치해 있으면서 DNA methylation enzyme (Dnmt3a)의 접근을 저해한다는 것이 Dnmt3a에 포함된 protein domain (ADD)의 crystal structure를 통해 밝혀졌지만, 세포안에서도 그러한 저해가 실제로 일어나 gene expression과 발달과정에 영향을 주는지는 증명되지 않았다. 본연구는protein engineering을 이용해 ADD domain을 변화시킨후 이변화가 세포안에서 어떤 영향을주는지 또한 발달과정에서 어떻게 발현되는지를 알아보고자 하였다.

1) Dnmt3a의 ADD domain characterization과 engineering

새로운 ADD domain의 crystal structure를 통해 H3K4me3뿐만 아니라 histone H3 threonine 3 phosphorylation (H3T3ph)도 Dnmt3a의 접근을 저해한다는것을 발견했다. Structure를 바탕으로한 protein engineering을 적용해 ADD domain이 H3K4me3 와 H3T3ph 를 각각 독립적으로 인식해 binding할 수 있도록 만들었고 (H3K4me3 binding: WWD and H3T3ph binding: R), 분자구조적인 방법과 histone modification peptide pull-down을 사용해 변이된 Dnmt3a를 증명하였다 (그림1 ).

2) 변이된 ADD domain이 포함된 Dnmt3a를 보유한 배아줄기세포의 epigenetic changes

변화된 Dnmt3a와 wild-type Dnmt3a를 DNA methylation이 모두 없어진 마우스 배아 줄기세포안에서 발현되도록 한 후 각자의 Dnmt3a가 binding 하는 게놈 부위와 그곳에서의 DNA methylation 차이, 그리고 연관된gene들의 expression정도를 측정하였다. H3K4me3에 binding하도록 변이된 Dnmt3a는 H3K4me3가 있는 다수의 CpG islands에 binding해서 DNA methylation을 유도하였고, 일부의 발달과정과 연결된 gene expression을 저해했다 (그림2). 더 많은 양의 H3K4me3를 가지고 있는 CpG islands가 더 많은 양의 변이된 Dnmt3a를 가지고 있는것으로 보아 ADD domain 의 화학적인 차이가 세포안에서도 실제로 중요한 요소임을 증명하였다. 더해서 항상 많은양으로 지속적으로 발현되는 housekeeping genes 보다는 developmental gene들이 CpG island의 DNA methylation에 의해 민감하게 조절되고 있음을 알수 있었다. H3T3ph는 세포분열 과정중의 특별한 시기에만 나타나는 histone modification으로 알려져 있으며 CpG islands와 관련이 없다. 따라서 H3T3ph에 binding하도록 변이된 Dnmt3a는 전체적인 DNA methylation이나 gene expression에 커다란 영향을 주지 못하였다.

3) 변이된 Dnmt3a가 세포 발달과정에 미치는 영향

H3K4me3에 binding하도록 만든 변이된 Dnmt3가 배아 발달과정과 관련된 gene들의 발현을 저해했기 때문에 다음 실험으로 마우스 배아 줄기세포를 신경세포로 분화시켜서 그차이를 살펴보았다. H3K4me3에 binding하도록 변이된 Dnmt3a를 가진 세포는 다른 세포들과는 달리 신경세포로 분화하지 못하였다. Teratoma실험에서도 이세포들은 분화하지 않는 세포로 남아있어서 여러 다른 배아 조직으로 분화한 wild-type Dnmt3a를 보유한 세포들과 큰 차이를 보였다 (그림3).

4) 변이된 Dnmt3a가 염색체 분열에 미치는 영향

H3T3ph에 binding하도록 변이된 Dnmt3a를 가진 배아줄기세포는 세포분열시에 염색체 분리가 정상적으로 이루어지지 않았을때 나타나는 특이적인 염색체의 이상현상을 보였다 (그림 4). Mitotic centromeres에 많은양의 H3T3ph가 있으므로 변이된 Dnmt3a가 이곳에 비정상적으로 binding해서 세포분열과정의 조절기작을 저해하는것으로 보여진다. 이를 자세히 증명하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.

본연구를 통해, 실제 세포안에서 Dnmt3a에 포함된 ADD domain의 histone modification의 반응 정도에 따라 DNA methylation과 gene expression이 민감하게 조절되고 이에 상응해 세포분화과정과 조직발달정도에서도 유의한 차이를 보이는 것을 알 수 있었다 (그림 5). 본연구는 epigenetic regulation에 중요한 역할을하는 ADD domain을 패러다임으로 사용해 1) histone modification들의 독립적이면서도 상호연결된 기작을 밝혔고, 2) 분자구조를 바탕으로한 protein engineering의 유용성을 보여 주었고, 3) 이를 통해 분명하게 연결된 histone modification과DNA methylation의 작용기작을 증명하였다. Dnmt3a 의 ADD domain은 암이나 두뇌 발달과 관련된 많은 질환과 연관성이 있으므로 본연구는 histone modification들을 읽을수 있는 단백질안의 다른 모듈들이 여러가지의 human 이상질환에 관련될 수 있음을 시사한다.

이번 연구는 The Rockefeller University의 Chromatin biology lab (Dr. David Allis)에서 노경민 박사가 박사후 과정동안 주도적으로 진행한 것으로 여러다른 분야의 연구자들의 도움을 받아 이루어진 결과들을 정리하여 발표한 것입니다. 노경민박사는 Albert Einstein College of Medicine의 Neuroscience lab (Drs. Suzanne Zukin and Michael Bennett)에서 transcription repressor가 뇌졸중에 미치는 기작을 연구해 박사학위를 받았고, 현재는 독일의 하이델베르그에 위치한The European Molecular Biology Laboratory (EMBL)에서 독립적인 연구를 진행하고 있습니다. EMBL은 유럽에서 손꼽히는 기초과학 연구소로, 가장 앞서나가는 기술을 도입한 다양한 core facilities와 협력하여 세계적으로 경쟁력있는 연구를 진행하고 있습니다. 노경민 박사는 human iPSC를 이용해서 neurodevelopmental diseases 기작을 연구하고 있으니 관심있는 분은 박사후과정으로 연락 바랍니다.