Identification and genetic manipulation of human and mouse oesophageal stem cells. Gut. 2015 Apr 20.pii: gutjnl-2014-3 08491. PMID: 25897018

Regenerative medicine을 위한 stem cell therapy에서는 tissue specific stem cell의 identification 및 expansion이 필수적이다. 이 를 위해서는 stem cell의 self-renewal 및 tissue reconstitution을 반영하는 assay system의 개발이 선행되어야 한다. 하지만 동물 실 험은 기술적으로 어려우면서도 최소 수개월 이상의 시간이 소요되기에 동물실험을 기반으로 tissue specific stem cell 을 연구하기에는 많은 제약이 따르게 된다. 그러한 이유로 현재 host tissue의 histology를 반영하면서도 (organotypic) 정량적으로 stem cell activity 를 계측할 수 있는 (clonal and quantifiable) 삼차원의 공 모양(sphere)의 체외 배양을 통해 epithelial stem cell의identification 및 e xpansion을 가능케 하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 연구 시작 당시 esophageal stem cell population이 아직 밝혀지지 않았 었는데, 이 역시 esophageal stem cell 의 특성을 반영할 수 있는 마땅한 assay 방법이 없었기 때문이기도 했다. 그래서 a novel 3-dim ensional organotypic esophagosph ere culture system의 개발을 통하여 esophageal stem cell의identification 및 expansion과 functional genetic study에 기여하고자 하는 목적으로 연구를 진행하게 되었다.

1. Development of mouse and human esophagosphere culture system

Stem cell research를 위해서는 먼저 stem cell의 중요한 특성인 self-renewal과 tissue reconstitution capability를 나타내는 assay system이 필요하며 이를 바탕으로 stem cell population의 identification 및 functional study가 진행되어야 한다.

본 연구에서는 Esophageal stem cell 연구를 위해 먼저 human and mouse esophagosphere culture system을 확립하고자 하였다. 본 연구팀에서는 fresh endoscopic biopsy sample로 부터 human esophagosphere culture을 확립할 수 있었는데 (그림 1a), esophageal stem cells을 stem/progenitor 상태로 maintenance and expansion 할 수 있는 progenitor culture와 differentiation 되는 sphere culture 두 단계로 확립하여 stem cell expansion 및 differentiation 각각의 연구가 가능하도록 하였다. 그림 1a에서 보이는 것처럼 progenitor culture에서는 esophageal basal layer에서 주로 발현되는 basal marker (CD49f, KRT14, p63)가 주로 발현되었으며 suprabasal layer에서 주로 발현되는 KRT4는 발현되지 않아 stem/progenitor cell status를 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 sphere culture에서는 나이테처럼 보이는 실제 esophagus의 histology와 비슷한 stratified squamous epithelium을 관찰할 수 있었으며, 바깥쪽에는 basal marker, 안쪽에는 suprabasal marker가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (organotypic).

이어서 mouse esophagosphere culture를 확립하여 mouse esophagosphere 역시 stratified squamous epithelium으로 이루어져 있으며, 바깥쪽에는 basal marker 안쪽에는 suprabasal marker가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (organotypic). 또한GFP및 RFP 를 발현하는 esophageal cell을 사용한 mixing experiment를 통하여 esophagosphere의 clonal generation을 확인할 수 있었으며 (data not shown), 이후 2년간 40회 이상의 in vitro passage 및 passaged cell의 subrenal capsule transplantation을 통한 stratified squamous epithelium의 generation을 통해 sphere-forming cell이 in vitro and in vivo self-renewal을 할 수 있는 stem cell characteristic을 지니고 있다는 것을 확인할 수 있었다 (그림 1c).

그림 1. Development of mouse and human esophagosphere culture system

2. Identification of human and mouse esophageal stem cells

다음으로는 위의 esophagosphere culture system을 바탕으로 human and mouse esophageal stem cell population을 identify하고자 하였다. 여러가지 cell surface marker들을 사용한 FACS analysis를 통하여human esophageal epithelial cell에서CD49f와 CD24의 expression이 가장 differential하다는 것을 확인하였다 (그림 2a). FACS sorting and esophagosphere culture 결과 CD49f^hiCD24^low cell이 esophagosphere를가장 잘 형성하는 반면 CD49f^lowCD24^hi cell이 가장 적게 형성한다는 것을 확인할 수 있었다 (그림 2b). 또한 cell cycle analysis를 통해CD49f^hiCD24^low cell과CD49f^lowCD24^low cell은 비슷한 속도로cell cycle이 진행되는 반면CD49f^lowCD24^hi cell에서cell cycle이 가장 느리다는 것을 확인할 수 있었다 (data not shown). 이상의 결과를 바탕으로 그림 2c와 같이CD49f^hiCD24^low stem cell이 CD49f^lowCD24^low early differentiating cell을 거쳐 CD49f^lowCD24^hi late differentiating suprabasal cell로 분화된다는 human esophageal stem cell differentiation model을 제시하게 되었다.

다음으로 mouse esophageal stem cell population을 보다 refine 하고자 하였다. 기존의 연구가 CD49f⁺CD71^low cell을mouse esophageal stem cell로 제시하였으나 CD71의 경우 in vivo 상의 basal/suprabasal layer에서의 expression이 일관되지 않아 stem cell과 differentiated cell의 mutual contamination이 꽤 발생할 소지가 있기 때문이다. Immunostaining을 통해 human에서와 마찬가지로 CD24 expression이 mouse에서도 suprabasal layer에만 국한되는 것을 확인할 수 있었고, FACS sorting, cell cycle analysis, and esophagosphere culture 결과 CD49f⁺CD24^lowCD71^low cell과CD49f⁺CD24^hiCD71^hi cell이 각각 가장 stem cell 및 viable differentiated cell의 characteristic에 잘 맞는다는 것을 확인할 수 있었고 (그림 2d-e), 이를 바탕으로 그림 2f와 같은 mouse esophageal stem cell differentiation model을 제시하게 되었다.

그림 2. Identification of human and mouse esophageal stem cells

3. The role of p63 in mouse and human esophageal stem cells

Esophageal stem cell research의 난점 중의 하나는 p63, Krt5, Krt14 등의 basal marker들이 trachea, skin, cervix, cornea, mammary gland 등에서도 발현된다는 점이다. 그 결과 Krt5^CreERT2 등의 inducible conditional knockout system을 이용하여 특정 유전자의 기능을 연구하고자 하더라도 해당 유전자의 다른 tissue에서의 기능 이상으로 인해 esophagus에서 연구하지 못하게 되는 경우가 종종 발생하는데, 즉 esophageal stem cell specific promoter가 아직 발견되지 않았다는 점에 기인한다. 또한 human esophagus의 경우 cell line이 아닌 primary cell 을 이용할 수 있는 마땅한 실험 방법이 아직 존재하지 않는다는 난점이 있었다.
그리하여 다음 연구로 위와 같은 이유로esophageal stem cell에서의 기능이 잘 밝혀지지 않은 p63가esophageal stem cell self-renewal 및 differentiation에 미치는 영향 대해 esophagosphere culture system을 이용하여 살펴보았다. Krt5^CreERT2;p63^f/f;R26^YFP mice에 tamoxifen을 주사한 후 esophagosphere culture를 하였을 때 그림 3a에서 보이는 것처럼 esophagosphere의 수와 recombined cell %가 감소할 뿐만 아니라 esophagosphere 모양도 비정상적으로 변형되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 shRNA를 이용하여 p63를 silencing 하였을 때 human esophagosphere 역시 감소함을 알 수 있었다 (그림 3b). 이상을 통해 p63가 mouse 및 human의 esophageal stem cell의 self-renewal 및 structural integrity 유지에 중요한 역할을 담당한다는 것을 알 수 있었다.

그림 4. The role of p63 in mouse and human esophageal stem cells

4. 연구성과 및 의의

본 연구는 human and mouse esophageal stem cells의 특성을 반영하고 보존할 수 있는 체외 배양법을 확립함으로써 무엇보다도 human esophageal stem cell을 identify 하였으며 mouse esophageal stem cell을 보다 refine 할 수 있었다. 또한stem cell therapy 에 필요한 충분한 수의 human and mouse esophageal stem cells의 ex vivo expansion이 가능함을 보일 수 있었다. 마지막으로 현재 esophageal specific promoter가 발견되지 않아 skin, airway, cervix, cornea, mammary gland 등 다른 tissue에서 lethality를 보이는 유전자의 경우 형질전환 생쥐모델을 이용한 esophageal stem cell specific research를 하기 어려운데 반해, 본 시스템을 이용할 경우 esophageal stem cell specific functional genetic study 및 human primary esophageal stem cell study가 가능함을 보였다. 본 연구를 통해 밝혀진 esophageal stem cell identity 및 esophagosphere culture system은 궁극적으로esophageal stem cell research 뿐만 아니라 esophageal inflammation 및 esophageal cancer 등의 연구에도 의미있는 기여를 할 것이다

5. 연구자 소개

본연구를 주도한 정영태 박사는 서울의대를 졸업하고 인턴을 수료한 후 도미하여 Johns Hopkins University School of Medicine에서 박사학위를 취득하였다. 이후 2010년 12월부터 Stanford University Cancer Institute 및 Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine에서 postdoc으로 Dr. Maximilian Diehn과 함께 cancer stem cell 을 연구하면서 airway stem cell, esophageal stem cell, lung cancer 등의 분야로 연구 영역을 넓히고 있다. Dr. Maximilian Diehn은 cancer stem cell 도 normal stem cell처럼 intracellular ROS level을 낮게 유지함으로써 therapeutic resistance를 보인다는 연구와 circulating tumor DNA를 검출하는 CAPP-Seq (CAncer Personalized Profiling by deep sequencing)의 개발로 혈액 검사를 통해 암 발생, 암재발을 진단 및 추적할 수 있다는 연구 성과 등으로 학계에 기여하고 있다.